1. 樣品預(yù)處理
1） 去除細(xì)胞。4℃，300 g，離心5 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管；
注意：對(duì)無(wú)細(xì)胞的樣品，可以跳過(guò)此步驟。
2） 去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。4℃，2000 g，離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管；
3） 去除大體積顆粒。步驟 2）得到的上清，4℃，14000 g，離心30 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管。
2. 純化柱預(yù)處理
1） 提前將純化柱（Exosome Purification Column (30 mL)）安裝在純化柱固定器（Purification Column Stand）上，純化柱下面放置廢液槽。放置于室溫30 min以上，恢復(fù)室溫；
注意：純化柱需充分平衡至室溫（18-25℃），溫度過(guò)低或過(guò)高，都會(huì)影響外泌體分離效果。
2） 檢查純化柱下端是否充滿液體。如果純化柱下端無(wú)空氣，可以跳過(guò)該步驟；若純化柱下端存在空氣，將純化柱倒置，打開(kāi)下端密封帽，用移液器或注射器取水或20%乙醇頂出空氣，在密封帽中充滿水或20%乙醇，再蓋上密封帽，放回固定器上；
3）先打開(kāi)純化柱頂蓋，再打開(kāi)下端的密封帽，棄去純化柱上的封柱液（可直接倒掉或者用移液器吸?。?，將適配器（Column Adapter (30 mL)）與純化柱連接，并從頂部加入加2倍柱體積（60 mL）PBS平衡純化柱，至下方?jīng)]有溶液流出。清洗過(guò)程中，純化柱的頂部篩板必須始終保持濕潤(rùn)。沖洗完成后，蓋上底端密封帽，斷開(kāi)適配器，加入3 mL PBS備用。
a. 注意要先打開(kāi)純化柱上蓋，再打開(kāi)下端的密封帽，否則空氣將進(jìn)入純化柱中，影響外泌體分離效果。
b. 在整個(gè)外泌體分離純化過(guò)程中，純化柱的頂部篩板必須始終保持濕潤(rùn)，否則影響外泌體分離效果。
c. 需要向純化柱中加入大體積溶液時(shí)，可以將適配器與純化柱連接，將溶液加入到適配器中。
d. PBS推薦新鮮配制并經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾，或采購(gòu)商業(yè)化無(wú)菌的PBS，避免微生物或顆粒物污染。PBS溶液使用前，必須平衡到室溫，否則純化柱中可能出現(xiàn)大量氣泡，影響外泌體分離效果。
3. 分離外泌體
1） 樣品上樣。移除純化柱中的PBS，在上方加入3 mL樣本；樣本不足3 mL，可用PBS補(bǔ)至3 mL，混勻后上樣。取下純化柱底部密封帽，等待樣本全部進(jìn)入純化柱內(nèi)后，再加PBS；
a. 如果樣品體積超過(guò)3 mL，建議試用50 kDa超濾管濃縮樣品至3 mL，注意濃縮體積不超過(guò)20倍。超濾濃縮方法詳見(jiàn)超濾管的說(shuō)明書(shū)。
b. 對(duì)于高粘度樣本，如血漿、血清、高粘度胸腹水等樣本，可取1.5 mL樣本，用PBS稀釋至3 mL，混勻后上樣。
c. 必須待樣品全部進(jìn)入篩板后，再加入PBS，避免樣品被稀釋影響分離效果。
2） 外泌體分離。先在純化柱下方準(zhǔn)備好1.5mL離心管，然后在純化柱上方加入1 mL PBS。待下方收集到1 mL餾分后，可加下一次1 mL PBS，換新的1.5 mL離心管收集。根據(jù)流出順序分別標(biāo)記餾分管編號(hào)。
3） 外泌體收集。收集8、9、10、11、12號(hào)餾分管即可獲取外泌體，其中9、10、11號(hào)餾分管的外泌體濃度更高。收集液可直接測(cè)定外泌體顆粒數(shù)和蛋白濃度。
4) 外泌體濃縮。測(cè)定收集外泌體的顆粒濃度和蛋白濃度，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，決定是否對(duì)外泌體收集液進(jìn)行濃縮。如濃縮，建議使用MWCO 50 kDa的超濾管，4000 g離心濃縮到目的體積即可。
4. 純化柱維護(hù)
1） 收集完所有餾分后，將適配器與純化柱連接，并從頂部加入至少2倍柱體積（60 mL）PBS清洗純化柱，至下方?jīng)]有溶液流出。
2） 再加1.5倍柱體積（45 mL）的20%乙清洗純化柱，至下方?jīng)]有溶液流出。
3） 最后取下適配器，向純化柱中加入5 mL 20%乙醇的封閉液，安裝純化柱頂蓋，然后在密封帽中充滿20%乙醇，蓋到純化柱下端出口，置于4℃直立保存。

1. 新購(gòu)買(mǎi)或使用后的純化柱，上篩板和白色瓊脂糖微球之間可能會(huì)出現(xiàn)一定的空隙，這是儲(chǔ)存和使用過(guò)程中凝膠沉降造成的，并不影響純化柱的性能，將上篩板向下推至無(wú)空隙即可正常使用；
2. 純化柱保存在封閉液中，封閉液為20%乙醇。20%乙醇建議現(xiàn)配現(xiàn)用，同時(shí)經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾、超聲或真空脫氣，避免造成純化柱出現(xiàn)大量氣泡，影響分離效果；
3. 每次純化柱使用前需要使用無(wú)菌并平衡至室溫的PBS清洗。PBS建議現(xiàn)配現(xiàn)用，同時(shí)經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾、超聲或真空脫氣，避免造成純化柱出現(xiàn)大量氣泡，影響分離效果；
4. 純化柱中間不能有氣泡，使用前后需認(rèn)真檢查，避免影響實(shí)驗(yàn)；
5. 純化柱可以反復(fù)利用，但是多次使用會(huì)影響效果，建議重復(fù)使用不超過(guò)5次；
6. 當(dāng)分離的外泌體進(jìn)行NGS或者其他組學(xué)分析時(shí)，為避免交叉污染，建議每個(gè)樣品使用一支新的純化柱。