（一）使用方法（外泌體分離使用方法）

1. 樣品預(yù)處理

1) 去除細(xì)胞。4℃，300 g，離心5 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管；

注意：對(duì)無細(xì)胞的樣品，可以跳過此步驟。

2) 去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。4℃，2000 g，離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管；

3) 去除大體積顆粒。步驟 2）得到的上清，4℃，14000 g，離心30 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管。

2. Spin Column 01離心柱預(yù)處理

1) 根據(jù)待分離外泌體樣本數(shù)量，從試劑盒中取出相同數(shù)量的Spin Column 01和Collection Tubes (2 mL)，打開Spin Column 01下端堵頭，將其放入Collection Tubes (2 mL)中，用移液器吸棄Spin Column 01上層的保護(hù)液體；

2) 向Spin Column 01中加入500 μL Solution A，300 g，離心1 min，棄去Collection Tubes中廢液；

3) 重復(fù)步驟2）1次；

4) 將Spin Column 01放入新的2 mL離心管中，用于下一步外泌體的分離。

注意：如果樣本體積不超過0.2 mL，也可以使用1.5mL離心管。

3. 分離外泌體

1) 將預(yù)處理后的樣本（50-500 μL）加入到上述預(yù)處理的Spin Column 01中，4℃，300g，離心1 min；

a. 如果樣品體積超過0.5 mL，建議試用50 kDa超濾管濃縮樣品至0.5 mL，注意濃縮體積不超過20倍。

b. 對(duì)高粘度樣本，如血漿、血清、胸腹水等樣本，可用等體積去離子水稀釋再加入到Spin Column 01中。

c. 對(duì)雜質(zhì)較多的樣本，如血漿、血清、胸腹水、牛奶等樣本，建議用PBS稀釋10倍，經(jīng)過50 kDa超濾管濃縮 10倍；然后加入剩余液體10倍體積的PBS，超濾濃縮10倍后再用Spin Column 01分離外泌體。d. 離心法分離時(shí)，控制離心力在300-500 g（若樣本粘度大，適當(dāng)增加離心力），才能實(shí)現(xiàn)良好的外泌體分離效果。

2) 取下Spin Column 01，離心管中液體即為分離的外泌體，取一部分進(jìn)行檢測(cè)，其余溶液置于-80℃保存。

注意：根據(jù)外泌體溶液性質(zhì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，選擇是否使用超濾管（MWCO：10 kDa）置換其他溶液。

（二）使用方法（游離染料去除）

1. Spin Column 01離心柱預(yù)處理

1) 根據(jù)染料去除樣本數(shù)量，從試劑盒中取出相同數(shù)量的Spin Column 01和Collection Tubes (2 mL)，打開Spin Column 01下端堵頭，將其放入Collection Tubes (2 mL)中，用移液器吸棄Spin Column 01上層的保護(hù)液體；

2) 向Spin Column 01中加入500 μL Solution A，300 g，離心1 min，棄去Collection Tubes中廢液；

3) 重復(fù)步驟2）1次；

4) 將Spin Column 01放入新的1.5 mL離心管中，用于下一步外泌體的分離。

2. 去除游離染料

1） 將熒光染料標(biāo)記的外泌體樣本（50-200 μL）加入到上述預(yù)處理的Spin Column 01中，4℃，300 g，離心1 min；

2） 取下Spin Column 01，離心管中液體即為分離的外泌體，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。