支原體檢測試劑盒由普諾賽技術(shù)團隊精心優(yōu)化，經(jīng)過長期測試，可用于檢測細胞培養(yǎng)基、血清和細胞培養(yǎng)液等生物制品中的常見支原體，包括精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）、口腔支原體（M.orale）、肺支原體（M.pulmonis）、牛支原體（M. bovis）和酵母菌支原體（M. yeatsii）等。針對常見支原體保守序列設(shè)計特異性引物，可以直接使用細胞培養(yǎng)液作為檢測模板，特異性擴增支原體DNA。本產(chǎn)品操作簡單、特異性強、靈敏度高。

試劑盒組成

操作步驟

注意：PCR反應(yīng)體系的液體配置過程請在無菌無支原體環(huán)境操作，如超凈臺或者生物安全柜，需嚴格無菌操作，避免外源污染造成結(jié)果假陽性。

1. 細胞培養(yǎng)48-72 h，建議待細胞密度生長至80%以上時，取10 μL細胞培養(yǎng)液做PCR模板備用。（懸浮細胞1500 rpm離心3 min，再取上清液）。

2. 在PCR專屬區(qū)域參照下表配置PCR反應(yīng)體系，需設(shè)置陰性對照（MycoFree  H₂O）與陽性對照（Positive Control）組。

PCR反應(yīng)體系配置建議：

3. 輕柔混勻體系，按照下表所示設(shè)置PCR反應(yīng)程序：

* 一般推薦的循環(huán)數(shù)為35，若需復(fù)測獲得更明亮的條帶才使用40循環(huán)。

4. PCR結(jié)束后應(yīng)盡快檢測，如無法立即檢測，可將PCR產(chǎn)物保存在4℃待用，不要存放超過一周。

5. 凝膠電泳：取10 μL產(chǎn)物，1-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（推薦160 V，15 min），用凝膠影像分析儀拍照并保存結(jié)果。

6. 通過與陽性對照組和陰性對照組結(jié)果比較，判斷樣品支原體是否存在污染情況。陽性條帶大小約250 bp，隨種屬差異略有浮動。

四、注意事項

1. 確保所有試劑在使用前徹底解凍（4℃冰箱放置2 h或常溫放置0.5 h）。解凍后請將所有組分離心（推薦1000 rpm，30 s）后混勻（尤其是液體量較少的組分，離心收集管壁液體），再使用。

2. PCR體系配置完成后應(yīng)盡快放入PCR儀反應(yīng)，或暫存于4℃冰箱保存（6 h以內(nèi)）。產(chǎn)品現(xiàn)配現(xiàn)用，不建議配置好的反應(yīng)體系過夜放置。

3. 試劑應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。產(chǎn)品若在4℃存放，請在3個月內(nèi)使用完畢。長期不使用請于-5~-20℃凍存。

4. 待檢測樣本取樣后應(yīng)48 h內(nèi)盡快檢測，若無法立即檢測，請低溫（-5~-20℃）保存并在一月內(nèi)檢測完畢。

5. 操作時請佩戴口罩，避免口腔中可能攜帶的支原體污染樣本造成假陽性結(jié)果。

6. 針對條帶較弱的樣本或其他存疑情況，可將樣本進行10倍濃縮后復(fù)檢確認。濃縮操作：12000 rpm離心3 min，去上清；加入原液1/10體積的無支原體純水（自備）再次混勻即可。

7. 所有產(chǎn)品請于保質(zhì)期內(nèi)使用，超出保質(zhì)期，必須放棄使用。