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直播答疑 | 難養(yǎng)細胞培養(yǎng)常見問題及解決方法
來源：Pricella 瀏覽量： 發(fā)布時間：2022-08-02 10:18:38
培養(yǎng)出狀態(tài)良好的細胞，是實驗成功的第一步。在7月20日開播的“常見難養(yǎng)細胞培養(yǎng)問題及解決方法”課程中，有很多老師就細胞培養(yǎng)提出了疑問。我們篩選出部分代表性問題，并作了詳細解答。
HCT 116細胞很難消化成單細胞懸液，請問怎么解決？
HCT 116細胞很好消化，一般消化1~2min就可以，但是由于細胞生長速度非常快，匯合度達到80%以上細胞就會開始擁擠，單個細胞形態(tài)變小，細胞之間的邊界變得模糊，這種過度擁擠的狀態(tài)會影響最后的消化分散效果。
要將細胞消化分散好，可以參考一下兩點建議進行處理：
1. 培養(yǎng)過程中細胞密度不要過高，80%~90%即可傳代，確保細胞不會過度密集；
2. 消化的時候胰酶量不要太多，一般T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動將瓶底覆蓋后吸出多余的胰酶，保留0.5mL左右胰酶消化，消化過程中不要晃動培養(yǎng)瓶，避免細胞沒分散好就從瓶底脫落。
從ATCC購得的HK-2細胞，傳2~3代就是狀態(tài)不好，細胞形態(tài)像碎了一樣，用的是DMEM/F12培養(yǎng)基和10%血清。請問怎么辦？
這是細胞培養(yǎng)條件適應的問題，ATCC的HK-2使用的是無血清培養(yǎng)基K-SFM，突然更換成DMEM/F12+10%FBS來培養(yǎng)，可能會出現(xiàn)細胞不適應以及狀態(tài)變差的情況。正確的辦法是先用原本的培養(yǎng)條件K-SFM擴增好之后，再嘗試更換培養(yǎng)基。更換培養(yǎng)基時，建議先將兩種培養(yǎng)基按比例混合使用后，再慢慢更換成想要的培養(yǎng)基。
SF9必須用密閉的培養(yǎng)瓶嗎？
常規(guī)細胞培養(yǎng)時用到的DMEM、1640、F-12K等培養(yǎng)基緩沖體系為NaHCO3，需要用CO2進行平衡，而培養(yǎng)SF9用的昆蟲培養(yǎng)基不含這種成分，在CO2存在的情況下會導致培養(yǎng)基變酸，影響細胞生長。所以SF9培養(yǎng)的環(huán)境是100%空氣，27℃~28℃，飽和濕度，直接將培養(yǎng)箱CO2濃度調為0即可，并非必須用密閉的培養(yǎng)瓶。
SP2/0養(yǎng)久了細胞狀態(tài)變差了，怎么辦？用什么樣的血清比較好？
細胞培養(yǎng)時間久了，狀態(tài)出現(xiàn)變化其實是比較常見的現(xiàn)象，細胞培養(yǎng)過程中需要控制的變量太多，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能會導致細胞狀態(tài)變差或者培養(yǎng)失敗。一般建議在細胞傳代3~5代，狀態(tài)良好時進行適當凍存，后續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)異常情況也可以用凍存的細胞進行補救。
選擇血清的標準，就是能把手頭在養(yǎng)的細胞養(yǎng)好就行，所以選擇的方法就是在準備更換血清批次前先用試用裝，確定該批次的血清培養(yǎng)自己的細胞是沒有問題的，然后再進行購買。注意要在當前批次血清用完之前就準備下個批次血清的篩選，避免出現(xiàn)選取篩選效果不好又沒有合適血清使用的情況。
A498細胞用MEM培養(yǎng)的情況下，細胞出現(xiàn)腫脹破膜怎么處理？
細胞出現(xiàn)裂解死亡可以從以下三個方面進行排查：
一是檢查細胞是否存在污染，細菌、真菌和支原體污染都有可能會導致細胞死亡；
二是檢查使用的培養(yǎng)基是否存在質量問題。如PH值、滲透壓出現(xiàn)異常也會導致裂解死亡，但是一般實驗室沒有檢測條件，可以嘗試更換培養(yǎng)基廠家或批號進行培養(yǎng)，如果后續(xù)培養(yǎng)正常則可能是培養(yǎng)基原因導致的；
三是培養(yǎng)箱環(huán)境是否出現(xiàn)問題。如培養(yǎng)箱溫度過高，水盤干了等情況也會導致細胞死亡，特別是培養(yǎng)箱水盤，如果干了會導致培養(yǎng)基蒸發(fā)加快，滲透壓升高從而導致細胞裂解死亡。
一般細胞培養(yǎng)結束，使用結束后怎么處理或銷毀？
實驗室細胞培養(yǎng)用過的試劑和耗材等廢棄物都屬于危險廢棄物，處理方法是統(tǒng)一收集后，用專用的滅菌鍋消毒處理（如果沒有專用的滅菌鍋，就用84消毒液等進行消毒后統(tǒng)一存放），然后交由有資質進行危廢處理的單位進行處理，避免對環(huán)境造成污染。
我養(yǎng)的HK-2動不動就浮起來，漂浮后還可以離心收集培養(yǎng)嗎？
要看是用的什么培養(yǎng)條件培養(yǎng)的。如果是適應了血清培養(yǎng)的HK-2貼壁正常，一般不容易漂；如果是K-SFM培養(yǎng)的HK-2，貼壁過程比較慢，也容易有漂浮的細胞。
K-SFM培養(yǎng)基因為沒有血清中促進細胞貼壁的成分，所以培養(yǎng)的大多數(shù)細胞都會存在貼壁困難的情況，在培養(yǎng)前可以先用明膠或多聚賴氨酸等對培養(yǎng)瓶進行包被，增強細胞貼壁能力，另外在傳代之后2~3天盡量不要去移動細胞。
漂浮的細胞一般情況下是可以收集后繼續(xù)培養(yǎng)的，但是在培養(yǎng)基中懸浮時間太長可能會導致細胞活力慢慢下降。培養(yǎng)2~3天時，如果大部分細胞貼壁，只有少量懸浮可以不用處理；但是如果是大部分細胞懸浮，只有少量貼壁，可以在換液過程中把上清中的細胞離心后單獨處理。
如何能讓HepG2細胞在培養(yǎng)皿中盡量長得滿一些，減少空隙？
Hep G2細胞的生長特點就是呈島狀生長，并且島狀生長的細胞擴張能力有限，長到一定大小之后就會堆積生長。要想細胞分散均勻，一方面是需要保證細胞消化過程中分散良好，另外一方面接種的初始密度不宜過低，否則就會有大面積的空白區(qū)域。
另外如果實驗需要Hep G2為分散良好的單層細胞，可以用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶后培養(yǎng)，細胞將會呈單層分散的形式生長，但是形態(tài)跟不包被時差異比較大，會變成長梭形細胞。
消化完后是用完全培養(yǎng)基還是不完全培養(yǎng)基終止消化的呀？
一般細胞用胰酶消化完之后使用完全培養(yǎng)基中止，起作用的主要是其中的血清成分，可以抑制胰酶的活性，所以理論上講也是可以直接用血清中止，只是比較浪費。另外如果培養(yǎng)的細胞是用的無血清培養(yǎng)基，那么在中止時就不能使用完培中止，而應該選用胰酶抑制劑。
懸浮細胞的增殖正常，但是細胞形態(tài)很不一致，有形成突觸樣的形狀，不呈現(xiàn)橢圓形，這是什么原因呢？
這要看具體是什么細胞，如果細胞本身就存在少量不同形狀的細胞，則是正常；如果原本形態(tài)正常，但是突然出現(xiàn)形狀變化，可能是培養(yǎng)條件改變導致的，需要在更換培養(yǎng)條件時注意。
細胞正常的形態(tài)圖片可以從兩個途徑獲取，一是在購買細胞的機構官網查詢，或索要細胞正常狀態(tài)圖片進行參考；二是可以查詢國內外權威的數(shù)據庫，可以參考：https://web.expasy.org/cellosaurus。
