細(xì)胞學(xué)堂 | 微血管內(nèi)皮細(xì)胞知識(shí)盤點(diǎn)

微血管內(nèi)皮細(xì)胞（microvascular endothelial cells,MVECs）構(gòu)成了血液與組織液之間的物理屏障，而且在機(jī)體的凝血與抗凝血、致炎與抗炎及免疫應(yīng)答等方面起著十分重要的作用，其體外培養(yǎng)模型廣泛應(yīng)用于相關(guān)研究。但由于不同組織器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在較大的異質(zhì)性，同時(shí)微血管內(nèi)皮細(xì)胞因解剖部位不同，在形態(tài)學(xué)、表型和功能上等方面也存在明顯異質(zhì)性，不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞之間是不可相互替代的，主要包括腸、肺、心臟、腦、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞等。

本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定方法及步驟，幫助您快速上手開展實(shí)驗(yàn)。

提取方法

微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取和培養(yǎng)有酶消化培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法、免疫磁珠法。

• 酶消化培養(yǎng)法

采用消化酶將對(duì)應(yīng)組織內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)如基質(zhì)、膠原蛋白、纖維蛋白等解離，使細(xì)胞分散，形成單細(xì)胞懸液后再接種進(jìn)行培養(yǎng)的方法。

主要包括：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及日齡的選擇(根據(jù)取材部位決定動(dòng)物日齡）→對(duì)應(yīng)部位的取材→組織的剪碎及清洗→加酶消化→離心去酶→計(jì)數(shù)后接種培養(yǎng)→細(xì)胞純化→細(xì)胞鑒定；

• 組織塊培養(yǎng)法

是將從體內(nèi)取出的組織剪切成一定大小的組織塊后，接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行的培養(yǎng)。

主要包括：試驗(yàn)動(dòng)物及日齡的選擇(根據(jù)取材部位決定動(dòng)物日齡）→對(duì)應(yīng)部位的取材→組織的剪切→接種培養(yǎng)。

• 免疫磁珠法

通過在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，篩選或去除所標(biāo)記的細(xì)胞，達(dá)到陽性或陰性選擇細(xì)胞的目的。

主要包括：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及日齡的選擇(根據(jù)取材部位決定動(dòng)物日齡）→對(duì)應(yīng)部位的取材→組織的剪碎及清洗→加酶消化→離心去酶→加入磁珠與細(xì)胞孵育→磁珠磁力架分選→收集沉淀技計(jì)數(shù)→接種培養(yǎng)。

大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取示意圖[1]

各種提取方法的優(yōu)劣勢(shì)

注意事項(xiàng)

1、試驗(yàn)動(dòng)物的日齡和健康狀態(tài)可能會(huì)影響目的細(xì)胞的活性、代次；

2、取材部位的分離需要盡可能多的剔除多余組織以及保證無菌；

3、得到大小適中、容易貼壁的組織塊是分離細(xì)胞的關(guān)鍵；

4、采用吹打法時(shí)，吹打管的規(guī)格、吹打的次數(shù)會(huì)直接影響細(xì)胞貼壁能力和細(xì)胞的純度；

5、雖然各種酶的消化活力有一定的組織特異性，但由于任一組織器官均不是由單一的組織細(xì)胞成分構(gòu)成，因此酶消化液常根據(jù)所分離培養(yǎng)細(xì)胞的種類等因素進(jìn)行篩選；

6、采用酶消化法時(shí)，消化時(shí)間和溫度的控制也特別重要。消化時(shí)間過長(zhǎng)、溫度過高不利于細(xì)胞的貼壁和伸展；消化時(shí)間過短、溫度過低則達(dá)不到組織分離的目的；

7、建議使用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)所需的微量元素、生長(zhǎng)因子等；

8、建議包被處理（比如PLL、明膠等），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，形態(tài)立體；

9、對(duì)于大部分細(xì)胞來說，同一種細(xì)胞，大鼠類的細(xì)胞代次會(huì)比小鼠細(xì)胞代次略高；

10、隨著傳代的增加，細(xì)胞的形態(tài)會(huì)發(fā)生變化。

鑒定指標(biāo)

• 顯微鏡觀察鑒定

可以初步觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)規(guī)律，細(xì)胞呈鵝卵石典型的鋪路石樣、多角形、梭形，細(xì)胞核大而清晰；

貼塊法獲取的肺微血管內(nèi)皮，呈鋪路石樣

貼塊法獲取的肺微血管內(nèi)皮，呈鋪路石樣

大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取過程[2]

• 特異性標(biāo)志

目前使用較多的是FactorⅧ、 vWF、和CD31的陽性表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]白祥慧，鄒登朗，祁得勝，等. 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2021.

[2]張帆. 單篩過濾法體外分離培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其鑒定[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2023.

[3]段佳熙，巨噬細(xì)胞外泌體介導(dǎo)慢阻肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[D].中南大學(xué)，2022.

[4]免疫磁珠法分離培養(yǎng)小鼠原代骨骼肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及鑒定[J].心臟雜志，2023.

[5]Wong E，Nguyen N，Hellman J.Isolation of primary mouse lung endothelial cells[J].J Vis Exp，2021，（177）：e63625.

[6]Sokol L，Geldhof  V，Garcia-Caballero M，et al.Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues:Small intestine,colon,heart,and liver[J].STAR Protoc，2021,2（2）：100489.