細胞學堂 | 原代細胞和RAW 264.7誘導破骨細胞攻略！

骨骼系統(tǒng)為支撐身體、協(xié)調(diào)軀體運動、控制礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和造血提供了重要的基礎。破骨細胞是由單核/巨噬細胞造血譜系前體細胞融合而成的特化細胞，在骨穩(wěn)態(tài)和健康維持中至關重要。已有大量實驗證實其細胞形成和功能失調(diào)與骨質(zhì)疏松癥、骨折愈合、骨關節(jié)炎和原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等密切相關。一直以來，破骨細胞作為“噬骨者（bone eaters）”，被聚焦于探討其在骨穩(wěn)態(tài)和疾病中的角色。

破骨細胞為終末分化細胞，不能傳代，光鏡下可觀察到破骨細胞胞體較大、多核、有偽足和突起等特征。

圖1. 破骨細胞形態(tài)

在實驗研究中，常通過誘導劑的誘導作用使體外培養(yǎng)的干細胞或單核細胞向破骨細胞分化，從而獲得破骨細胞。此方法獲得的是破骨樣細胞，破骨樣細胞是指原代或經(jīng)誘導而來具有破骨細胞特性的細胞，近年來廣泛用于破骨細胞的研究。誘導法可獲得的細胞純度高、數(shù)量大，可滿足各種生化和分生實驗。常見的破骨誘導方法有2種：

原代細胞誘導

提取原代細胞，用巨噬細胞集落刺激因子( M-CSF），和核因子KB 受體活化因子配體( RANKL )誘導。

可使用25μg/L M-CSF+50μg/L RANKL的α-MEM完全培養(yǎng)基誘導，隔3天換液一次，培養(yǎng)至第5天開始出現(xiàn)體積較大的破骨細胞。

目前發(fā)現(xiàn)的可誘導分化為破骨細胞的細胞系常見的是小鼠RAW 264. 7細胞系，下面我們以這個細胞為例介紹一下它的誘導方法。

RAW 264.7誘導

誘導試劑：可以用LPS誘導，RANKL誘導，或者M-CSF+ RANKL誘導。

1. LPS誘導：10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、100ng/mL LPS均能誘導，但30、50、100ng/mL LPS誘導的多核細胞數(shù)量更多，且30ng/mL LPS誘導的多核細胞大小明顯增加。

圖2. 不同濃度LPS誘導破骨

2. RANKL誘導：用含100μg/L RANKL的α-MEM完全培養(yǎng)基誘導，隔天換液一次，誘導培養(yǎng)至第4~5天出現(xiàn)大量多核細胞。

3. M-CSF+ RANKL誘導: 使用100 ng /mL RANKL 與 100 ng /mL M-CSF的DMEM完全培養(yǎng)基，每兩天更新培養(yǎng)液一次，第4天左右開始出現(xiàn)破骨細胞。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

TRAP主要反映了破骨細胞的活性及骨吸收能力，是破骨細胞的良好標志物,也是最常用的鑒定方法。待誘導出破骨細胞，可根據(jù)以下步驟進行鑒定。

TRAP染色步驟: 2.5%戊二醛固定細胞10 min，蒸餾水充分沖洗，用TRAP染液處理50 min，蒸餾水充分沖洗后甘油封片。陽性染色細胞呈紅色，定位于胞漿, 陰性染色細胞呈黃色。

圖3. 破骨細胞經(jīng)TRAP染色

注意事項

原代細胞誘導形成的成熟破骨細胞數(shù)量及純度有限，但骨吸收活性強；RAW264.7細胞系誘導產(chǎn)生的破骨細胞數(shù)量多純度高，但吸收活性弱；

如果培養(yǎng)時，鏡下較多細胞出現(xiàn)偽足時，細胞整體狀態(tài)可能不好，這時的細胞不適合用于誘導破骨；

RAW264.7細胞的傳代次數(shù)對其能否誘導成破骨細胞至關重要，代數(shù)越低，細胞的分化能力越高；

原代細胞誘導培養(yǎng)形成的破骨細胞周期長，一般在9-10天時才達到最佳狀態(tài)；RAW 264.7誘導培養(yǎng)的周期稍短，一般在第5~6天時出現(xiàn)大量破骨細胞；

除了TRAP染色鑒定破骨細胞，通過觀察細胞核的數(shù)量以及降鈣素受體染色和觀察骨（牙）片吸收陷窩，可以進一步鑒定破骨細胞是否具有骨吸收能力。

參考文獻

[1] 付應霄, 顧建紅, 王世濤,等. 2種方法誘導形成的破骨細胞特性比較[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2013, 33(1):5.

[2] 王曉庚, 劉文佳, 周洪,等. 不同濃度破骨細胞分化因子和巨噬細胞集落刺激因子體外誘導大鼠破骨樣細胞形成的研究[J]. 口腔醫(yī)學, 2008, 28(4):4.

[3] 胡澤兵, 曹新生, 張舒. 破骨細胞體外培養(yǎng)技術[C]// 國際骨質(zhì)疏松研討會. 2014.

[4] Xiao Y ,  Cao Y ,  Song C , et al. Cellular study of the LPS‐induced osteoclastic multinucleated cell formation from RAW264.7 cells[J]. Journal of Cellular Physiology, 2020, 235(2457-2473).

[5] 楊也, 楊家福, 鐘霞,等. 少陽生骨方含藥血清對Raw264.7細胞向破骨細胞分化的影響及機制研究[J]. 世界最新醫(yī)學信息文摘, 2020(36):4.

[6] 董世武, 胡文輝. 破而后立:骨骼系統(tǒng)中破骨細胞新功能解析[J]. 陸軍軍醫(yī)大學學報, 2022, 44(1):10.