MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞是從MC3T3-E1細(xì)胞系中分離出的亞克隆之一，在含抗壞血酸和3~4 mM無(wú)機(jī)磷酸鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表現(xiàn)出高水平的成骨細(xì)胞分化。MC3T3-E1 Subclone 24和MC3T3-E1 Subclone 30在含抗壞血酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表現(xiàn)出很差的成骨細(xì)胞分化，不形成ECM，可以作為MC3T3-E1 Subclone 14的陰性對(duì)照。

氣相：空氣，95%；CO₂，5%

溫度：37℃

MC3T3-E1 Subclone 14

細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟

1

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞正常培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可用胰酶消化，計(jì)數(shù)；

2

按2~3×10⁴ cells/cm²的細(xì)胞密度接種在12孔板中（具體接板數(shù)量以實(shí)際預(yù)實(shí)驗(yàn)情況為準(zhǔn)），每孔加入1 mL的MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞完全培養(yǎng)基；

3

將接種好的MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞置于37℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

4

誘導(dǎo)試劑配置：MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和添加物三部分組成，使用前將各組分混勻后即可得到成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

5

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~95%時(shí)，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向12孔板中加入1 mL預(yù)熱的MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

6

每隔48~72h更換預(yù)熱的新鮮的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

7

誘導(dǎo)培養(yǎng)2~4周，期間注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定是否進(jìn)行下一步染色鑒定。

開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度可控制在90%~95%，注意避免細(xì)胞過(guò)飽和導(dǎo)致細(xì)胞卷邊漂起或者狀態(tài)不佳。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前確保細(xì)胞狀態(tài)，盡可能使用早代次的細(xì)胞開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞鋪板需均勻，鋪板不均勻可能導(dǎo)致分化不均勻、分化比例低、分化過(guò)程中細(xì)胞漂浮等問(wèn)題。

由于誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，為防止細(xì)胞脫落，可提前使用明膠包被培養(yǎng)板。

細(xì)胞換液或者添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基時(shí)需注意：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基提前37℃復(fù)溫；換液時(shí)可留一點(diǎn)原液作為緩沖，加液時(shí)槍頭沿壁逐滴加入，操作應(yīng)迅速，盡量避免在超凈臺(tái)內(nèi)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同時(shí)手法要輕柔；這樣對(duì)細(xì)胞的沖擊最小，否則極易導(dǎo)致細(xì)胞卷邊飄起。

避免長(zhǎng)時(shí)間將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱外進(jìn)行觀察，并盡量減少培養(yǎng)板的晃動(dòng)，以防細(xì)胞卷邊或漂浮。

拍照時(shí)可留少量PBS，減少光圈的出現(xiàn)，以便呈現(xiàn)更好的拍攝效果。