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細(xì)胞學(xué)堂 | 轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VS穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
來(lái)源：Pricella 瀏覽量： 發(fā)布時(shí)間：2024-12-12 13:00:00
細(xì)胞轉(zhuǎn)染作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，其原理在于，在一定條件下，細(xì)胞能夠主動(dòng)或被動(dòng)地導(dǎo)入外源基因（DNA、RNA）等遺傳物質(zhì)，從而獲得新的表型特性。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類(lèi)。
本期細(xì)胞學(xué)堂將對(duì)這兩種轉(zhuǎn)染方式的原理、操作及轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行全面的比較分析，幫助您輕松選擇適合的轉(zhuǎn)染技術(shù)，順利開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)原理對(duì)比
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
指通過(guò)特定方法將外源基因（DNA、RNA）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但這些外源遺傳物質(zhì)不會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中。因此，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，這些外源基因會(huì)逐漸被稀釋?zhuān)罱K完全丟失，由外源基因所攜帶的功能也隨之消失。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常用于需要快速、短期內(nèi)觀(guān)察外源基因表達(dá)效果的實(shí)驗(yàn)。
圖1. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方式
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
指通過(guò)特定技術(shù)將外源基因（DNA）整合到宿主細(xì)胞的染色體中，確保目的基因能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期且穩(wěn)定地表達(dá)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，外源基因的表達(dá)會(huì)被子代細(xì)胞持續(xù)表達(dá)。然而，需要注意的是，外源基因整合到宿主基因組的過(guò)程在大多數(shù)情況下是隨機(jī)的，這些步驟確實(shí)受到細(xì)胞復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的影響，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。但通過(guò)設(shè)計(jì)的篩選策略，可獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株。因此，選擇合適的轉(zhuǎn)染策略和篩選方法至關(guān)重要。
圖2. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方式
操作過(guò)程對(duì)比
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在實(shí)驗(yàn)步驟上既有相似之處，也存在顯著差異，尤其是在實(shí)驗(yàn)周期和操作復(fù)雜度方面。以下是這兩種技術(shù)的流程對(duì)比（見(jiàn)圖3、圖4）：
圖3. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染流程圖
圖4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染流程圖
相似之處
細(xì)胞準(zhǔn)備：都需要選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，并將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以確保細(xì)胞處于最佳狀態(tài)，便于后續(xù)的轉(zhuǎn)染操作。
質(zhì)粒選擇：質(zhì)粒構(gòu)建需考慮實(shí)驗(yàn)需求，包括質(zhì)粒大小、元件組成、復(fù)制起點(diǎn)及細(xì)胞適應(yīng)性等因素。同時(shí)，確保質(zhì)粒的濃度和純度符合轉(zhuǎn)染要求。
轉(zhuǎn)染方法選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞類(lèi)型，可以選擇不同的轉(zhuǎn)染方法，包括物理法（如電穿孔法）、化學(xué)法（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法）或生物法（如慢病毒感染法）等。
轉(zhuǎn)染操作：轉(zhuǎn)染操作因所選方法而異。例如，在化學(xué)或生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中，通常需要將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑混合形成復(fù)合物，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；而在物理轉(zhuǎn)染方法（如電穿孔法）中，則通常將質(zhì)粒DNA懸浮在特定緩沖液中，通過(guò)電場(chǎng)作用導(dǎo)入細(xì)胞。
不同之處
與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的特有步驟如下：
抗生素篩選：利用抗生素抗性標(biāo)記篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。
克隆選擇：從篩選后的細(xì)胞群體中挑選單細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)增，以確保基因能穩(wěn)定表達(dá)。
細(xì)胞擴(kuò)增與驗(yàn)證：通過(guò)多輪篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確認(rèn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)情況。
長(zhǎng)期維持與監(jiān)測(cè)：定期監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)，確?；虮磉_(dá)和細(xì)胞功能的穩(wěn)定性。
操作過(guò)程對(duì)比
細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，形成一道難以穿透大分子物質(zhì)屏障，尤其是對(duì)同樣帶負(fù)電荷的大分子物質(zhì)（如DNA和RNA，因其具有帶負(fù)電的磷酸骨架）而言。目前，研究人員已開(kāi)發(fā)出多種轉(zhuǎn)染技術(shù)幫助這些大分子穿越這一屏障。這些技術(shù)大致可以分為化學(xué)法、物理法和生物法三大類(lèi)。不同轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果的影響顯著，且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所適用的轉(zhuǎn)染技術(shù)也存在明顯差異。接下來(lái)，我們將詳細(xì)探討這些轉(zhuǎn)染技術(shù)的適用范圍及其之間的差異。
化學(xué)方法轉(zhuǎn)染
原理：利用帶正電荷載體分子與帶負(fù)電荷的核酸形成核酸-試劑復(fù)合物，并利用細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
轉(zhuǎn)染 技術(shù) | 特點(diǎn) | 主要 應(yīng)用 |
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 | 適用性廣 重復(fù)性好 對(duì)細(xì)胞有選擇性 轉(zhuǎn)染效率受細(xì)胞類(lèi)型影響 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染/ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
磷酸鈣法 | 操作簡(jiǎn)單 重復(fù)性差 不能用于原代細(xì)胞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染/ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
EDAE-葡聚糖法 | 對(duì)細(xì)胞有一定毒性 一般用于特定細(xì)胞 不能用于原代細(xì)胞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
陽(yáng)離子聚合物（如PEI、PLL等）轉(zhuǎn)染法 | 適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞 血清、抗結(jié)團(tuán)劑等物質(zhì)會(huì)干擾復(fù)合物的形成，影響轉(zhuǎn)染效率 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染/ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
物理方法轉(zhuǎn)染
原理：在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)的孔從而導(dǎo)入DNA。
轉(zhuǎn)染 技術(shù) | 特點(diǎn) | 主要 應(yīng)用 |
電穿孔法 | 適應(yīng)性廣 細(xì)胞致死率高 轉(zhuǎn)染DNA需求量大 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染/ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
顯微注射法 | 操作難度高 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限 適用范圍窄 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染/ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
生物學(xué)方法轉(zhuǎn)染
原理：利用基因工程病毒轉(zhuǎn)染非病毒基因到細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染 技術(shù) | 特點(diǎn) | 主要 應(yīng)用 |
腺病毒 | 適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 特定宿主細(xì)胞 需考慮安全因素 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 |
逆轉(zhuǎn)錄病毒 | 適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 攜帶基因不能太大 特定宿主細(xì)胞 需考慮安全因素 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
慢病毒 | 周期長(zhǎng) 特定宿主細(xì)胞 | 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染/ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染法是目前使用最廣泛的轉(zhuǎn)染方式，具有相對(duì)較低的細(xì)胞毒性。無(wú)論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，為了獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，通常都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行測(cè)試和優(yōu)化。
選擇哪一種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VS穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
上文我們介紹了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原理、操作方法及轉(zhuǎn)染技術(shù)。在選擇轉(zhuǎn)染方式時(shí)，還需綜合考慮實(shí)驗(yàn)的具體需求、成本、時(shí)間等因素。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常在轉(zhuǎn)染后24-96 h內(nèi)收集細(xì)胞，這種方法適合需要快速獲得基因表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，以及觀(guān)察目的基因過(guò)表達(dá)或干擾效果的實(shí)驗(yàn)。
相比之下，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常需要2-3周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，更適用于長(zhǎng)期藥理學(xué)研究、基因治療或需要對(duì)基因進(jìn)行插入、敲除等編輯操作的實(shí)驗(yàn)。
綜上所述，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，適合快速、低成本、短期的實(shí)驗(yàn)；而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雖然操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、成本較高，但其更適用于長(zhǎng)期研究、基因治療和基因功能探索等方向。
以上是關(guān)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原理、操作及轉(zhuǎn)染方法的比較分析，更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專(zhuān)欄~
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