腦卒中已成為全球第二大死亡原因和第三大致殘?jiān)?，其中缺血性腦卒中占80%以上。氧糖剝奪/再灌注（Oxygen Glucose Deprivation/Reperfusion, OGD/R）細(xì)胞模型是研究缺血性腦卒中的理想細(xì)胞模型，它通過短時(shí)間內(nèi)剝奪細(xì)胞的營養(yǎng)和氧氣，再復(fù)糖復(fù)氧來模擬體內(nèi)細(xì)胞在缺血缺氧后再灌注的損傷過程。然而，在構(gòu)建氧糖剝奪/再灌注細(xì)胞模型的實(shí)際操作過程中，我們可能會(huì)遇到各種問題。

? 引用普諾賽^?產(chǎn)品：

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以下兩種任選其一即可（方法②更容易實(shí)現(xiàn)）：

1

乏氧細(xì)胞培養(yǎng)箱（2% O₂, 5% CO₂, 93% N₂三氣培養(yǎng)箱）

2

乏氧盒/乏氧袋+厭氧產(chǎn)氣袋

主要為以下三種細(xì)胞：

1

神經(jīng)細(xì)胞（HT22、SH-SY5Y、PC12細(xì)胞系及原代神經(jīng)細(xì)胞等）

2

小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞系及原代小膠質(zhì)細(xì)胞等）

3

腦內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd.3細(xì)胞系及原代腦內(nèi)皮細(xì)胞等）

1

培養(yǎng)基：細(xì)胞對應(yīng)的培養(yǎng)基、無糖培養(yǎng)基

2

其他試劑：FBS、雙抗、PBS

3

檢測試劑：CCK8

1

將細(xì)胞懸液用含有10% FBS的完全培養(yǎng)基稀釋，然后以適宜的密度、體積接種在96孔板中（96孔板需設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)細(xì)胞接種孔數(shù)應(yīng)滿足不少于5個(gè)的要求），在37℃，5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細(xì)胞貼壁生長。

2

待細(xì)胞貼壁后，從96孔板中棄去各孔中原有完全培養(yǎng)基，用室溫的PBS清洗1遍。

3

進(jìn)行氧糖剝奪處理：在實(shí)驗(yàn)組96孔板中，將培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基，并放置在乏氧細(xì)胞培養(yǎng)箱或含有厭氧產(chǎn)氣袋的乏氧盒/乏氧袋中，培養(yǎng)不同的時(shí)間段（如2、4、6、8、10、12 h等）。對照組的培養(yǎng)基更換為新鮮完全培養(yǎng)基，放回37℃，5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

4

進(jìn)行復(fù)糖復(fù)氧處理：在達(dá)到預(yù)定的氧糖剝奪時(shí)間后，將實(shí)驗(yàn)組的96孔板從乏氧細(xì)胞培養(yǎng)箱或乏氧盒/乏氧袋中取出，棄去孔中的無糖培養(yǎng)基，并更換為細(xì)胞對應(yīng)的完全培養(yǎng)基，放置在37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)。

5

完成復(fù)糖復(fù)氧處理后，對照組和實(shí)驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)，計(jì)算在不同OGD/R造模條件下的細(xì)胞存活率。

6

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)需求，確定最適合的OGD/R模型造模條件。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，需保持細(xì)胞接種密度一致（建議細(xì)胞匯合度控制在70-80%之間），使用不同規(guī)格的孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，需根據(jù)每孔面積對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行合理換算。

更換培養(yǎng)基時(shí)，一定要用室溫的PBS輕柔清洗細(xì)胞，以去除孔內(nèi)殘留的完全培養(yǎng)基，避免對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。更換培養(yǎng)基時(shí)，動(dòng)作一定要輕柔，避免對細(xì)胞造成損傷。

在進(jìn)行氧糖剝奪處理時(shí)，每孔的無糖培養(yǎng)基體積應(yīng)適中，不宜太大，避免培養(yǎng)基中溶氧對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。一般來說，96孔板每孔加0.1 mL無糖培養(yǎng)基，24孔板每孔加0.2 mL，12孔板每孔加0.5 mL，6孔板每孔加1 mL（具體體積可根據(jù)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行微調(diào)）。

即使是相同的細(xì)胞系，不同來源的細(xì)胞想要達(dá)到相同的細(xì)胞存活率，所需的條件也可能會(huì)有細(xì)微差別。因此，一定要自己用一株細(xì)胞去篩選合適的OGD/R細(xì)胞造模條件，不可完全照搬文獻(xiàn)或他人的方法。

當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多或狀態(tài)不好時(shí)，采用相同的OGD/R細(xì)胞造模條件可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生存率發(fā)生顯著變化（急劇下降或升高）。此時(shí)，應(yīng)該復(fù)蘇新的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。