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實(shí)戰(zhàn)分享 | 中性粒細(xì)胞的高效分離技巧分享
來源：Pricella 瀏覽量： 發(fā)布時(shí)間：2024-08-07 13:42:00
中性粒細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)中豐度最高的細(xì)胞之一，不僅參與天然免疫反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫。隨著深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，受多種細(xì)胞因子的影響，中性粒細(xì)胞還會(huì)向N1、N2型腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞的極化。相較于血液和腹腔，小鼠骨髓是一個(gè)便捷的中性粒細(xì)胞儲(chǔ)存庫。無論是在穩(wěn)態(tài)下，還是在各種感染和非感染的炎癥條件下，都可以分離出大量的中性粒細(xì)胞。
本期，我們非常榮幸地聯(lián)系到了來自南昌大學(xué)的王老師，與我們分享她寶貴的科研經(jīng)驗(yàn)。為了滿足大量中性粒細(xì)胞的科研需要，王老師所在的課題組參照現(xiàn)有的文獻(xiàn)，總結(jié)出一個(gè)較可靠的中性粒細(xì)胞的分離獲取方法。接下來是王老師在中性粒細(xì)胞獲取過程中積累的豐富經(jīng)驗(yàn)和深刻心得，一起來實(shí)戰(zhàn)學(xué)習(xí)吧！
? 作者單位：南昌大學(xué)
? 發(fā)表期刊：
Advanced Healthcare Materials（IF=10）
? 文章標(biāo)題：
A Biomimetic Nanoplatform with Improved Inflammatory Targeting Behavior for ROS Scavenging‐Based Treatment of Ulcerative Colitis
? 引用普諾賽?產(chǎn)品：
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
RAW 264.7 (小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞) | CL-0190 |
Caco-2 (人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞) | CL-0050 |
（點(diǎn)擊產(chǎn)品貨號(hào)查看產(chǎn)品詳情）
中性粒細(xì)胞分離步驟
溶液配制
Percoll工作液（100% Percoll）：將10×HBSS緩沖液（不含鈣、鎂或酚紅）與無菌Percoll原液按照1：9的比例（V/V）配成混合液。輕輕翻轉(zhuǎn)幾次，不要形成旋渦。
1×HBSS-0.38%檸檬酸鈉緩沖液（250 mL）：將0.95 g檸檬酸鈉溶于25 mL超純水中，超聲混勻，再加200 mL超純水及25 mL的10×HBSS，超聲混勻后4℃?zhèn)溆谩?/p>
用Percoll工作液和1×HBSS-0.38%檸檬酸鈉緩沖液配置52%、64%和72%的Percoll稀釋液（溶液配制均在無菌環(huán)境下操作）。
中性粒細(xì)胞分離
選用7周的C57BL/6N小鼠，通過腹腔注射大腸桿菌K12中的脂多糖，以激活小鼠體內(nèi)的中性粒細(xì)胞。
注射6 h后將小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，立即切下其后肢的脛骨和股骨，去除所有附著的組織和皮膚。將脛骨和股骨浸泡在1×HBSS-0.38%檸檬酸鈉緩沖液中。
剪斷脛骨股骨兩端，用注射器向脛骨股骨中注入緩沖液，通過吹打得到骨髓細(xì)胞重懸液，一直吹到骨片泛白為止。
沖洗下來的骨髓細(xì)胞重懸液過70 μm尼龍篩網(wǎng)，230×g離心6 min，收集細(xì)胞。
棄上清，用2 mL緩沖液重懸細(xì)胞，再加緩沖液至40 mL，230×g離心6 min。
棄上清，將細(xì)胞重懸獲得骨髓細(xì)胞液（2 mL）。
取一個(gè)新離心管，依次將濃度分別為72%、64%、52%的三種Percoll溶液輕輕加入干凈的15 mL離心管中，將細(xì)胞懸液輕輕置于濃度為52%的Percoll溶液上。
4℃離心1545×g，30 min，收集Percoll溶液中濃度為64%和72%的細(xì)胞內(nèi)容物。
吸取含有中性粒細(xì)胞的細(xì)胞液，加入1×HBSS-0.38%檸檬酸鈉緩沖液，1545×g，5 min，棄上清，重復(fù)2次。
加入三倍體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打均勻，放置3 min，待紅細(xì)胞完全裂解。
加入3 mL 1×PBS混勻后，1000 rpm，3 min離心。
棄上清，3 mL 1×PBS重復(fù)洗1次，得到小鼠骨髓中性粒細(xì)胞懸浮液，暫時(shí)不用，可凍存于-80 ℃。
獲取的中性粒細(xì)胞可采用流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡等儀器進(jìn)行表征。
注意事項(xiàng)
在處理小鼠前，可通過腹腔注射脂多糖（LPS-EK）到小鼠體內(nèi)，以最大限度地提高中性粒細(xì)胞上粘附蛋白的表達(dá)。
剪斷脛骨股骨兩端后，用注射器向脛骨股骨中吹灌緩沖液這一步驟，建議選用較小的針頭進(jìn)行操作。同時(shí)，不要使用得到的骨髓細(xì)胞重懸液反復(fù)沖洗，以減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。
初步獲取的骨髓細(xì)胞重懸液需先經(jīng)70 μm尼龍篩網(wǎng)過濾，再進(jìn)行下步操作。
加入不同梯度的分離液及骨髓細(xì)胞液時(shí)，操作要輕柔，一點(diǎn)一點(diǎn)加入。注意不同梯度的分離液之間分層要明確，肉眼可見到明顯的分層時(shí)才可加骨髓細(xì)胞液，這一步是分離細(xì)胞成功的關(guān)鍵。
整個(gè)操作過程盡量在無菌環(huán)境下操作，減少微生物對(duì)細(xì)胞的污染。
非常感謝王老師關(guān)于中性粒細(xì)胞分離過程的經(jīng)驗(yàn)分享，希望這些經(jīng)驗(yàn)?zāi)軐?duì)大家的研究工作有所幫助。同時(shí)，我們也熱烈歡迎更多老師投稿，分享您在科研領(lǐng)域的干貨和心得體會(huì)，共同促進(jìn)科研交流和進(jìn)步！
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