氧化應(yīng)激損傷在眾多的疾病發(fā)生、發(fā)展和治療過程中的作用越來越引起關(guān)注?；钚匝酰≧OS）是細(xì)胞內(nèi)引起氧化應(yīng)激損傷的主要活性物質(zhì)，因此對細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行測定是進(jìn)行有關(guān)病理機(jī)制研究和治療效果評價(jià)的重要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一。目前，最常用的測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平的方法是利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行檢測。 

一般來說，可以根據(jù)對細(xì)胞刺激時(shí)間不同，選擇先裝載探針再刺激（適合刺激時(shí)間較短的實(shí)驗(yàn)），或者先刺激再裝載探針（適合刺激時(shí)間較長的實(shí)驗(yàn)）。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)即使是刺激時(shí)間較短的實(shí)驗(yàn)，采用先刺激再裝載探針的順序，實(shí)驗(yàn)效果也會更好，因?yàn)榇碳ぷ饔玫郊?xì)胞上需要一定時(shí)間才能使細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，而刺激后直接開始探針裝載的20-30min期間就可以使細(xì)胞充分產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，更加節(jié)省時(shí)間。

由于測定細(xì)胞內(nèi)ROS要充分保證細(xì)胞的活力和貼壁狀態(tài)（尤其是用于熒光成像的樣品），因此實(shí)驗(yàn)過程中的稀釋液和清洗探針的緩沖液等最好全部使用無血清培養(yǎng)液。

ROS探針的熒光信號可以使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等多種方式進(jìn)行檢測。我們最常用的是共聚焦熒光顯微鏡，因?yàn)樵摲椒ㄔ诒ＷC各組熒光成像參數(shù)條件一致的情況下，一方面可以提供可視化的熒光圖像用于直觀比較各組熒光信號強(qiáng)弱，另一方面可以通過平均熒光強(qiáng)度分析實(shí)現(xiàn)對各組細(xì)胞ROS水平的半定量分析。

利用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行熒光成像測定時(shí)，有時(shí)掃描第一遍時(shí)探針被激發(fā)的效果不好，可以在同一位置連續(xù)掃描三次及以上，使熒光分子被充分激發(fā)，再進(jìn)行數(shù)據(jù)保存。

要想獲取更加準(zhǔn)確的熒光圖像數(shù)據(jù)，方便后續(xù)進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度分析，就需要調(diào)整成像參數(shù)（主要包括激光強(qiáng)度、pinhole大小、信號增益值和掃描速度等）以控制好圖像的熒光強(qiáng)度，防止圖像過曝。通常我們會使用理論上熒光信號最強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行成像參數(shù)優(yōu)化，隨后對其他實(shí)驗(yàn)組也采用相同參數(shù)進(jìn)行成像，以此確保獲得的各組圖像的熒光強(qiáng)度差異能夠準(zhǔn)確反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平差異。